Хімічна будова ДНК

29.09.2015

Хімічна будова ДНК

Одне з найбільш чудових досягнень сучасної біохімії — це встановлення будови дезоксирибонуклеїнової кислоти з точки зору як її складу молекули, так і її просторової конфігурації.

Якщо вдасться встановити, що ДНК являє собою речовина, відповідальна за передачу спадкових особливостей на молекулярному рівні, то стане можливим встановити абсолютно певну залежність між цитологічної картиною поведінки хромосом і будовою і метаболізмом ДНК. Цікаво, що у результаті ряду дуже дотепних експериментів і теоретичних побудов така залежність дійсно почала вимальовуватися. У цій сфері ще багато невідповідностей і досить сміливих екстраполяції, однак сучасний стан питання дає підстави для оптимістичних очікувань.

У 1948 р. уявлення про ДНК, як про ланцюга, що складається з періодично повторюваних тетрануклеотидных одиниць, отримало серйозний удар з боку Вішера і Чаргаффа, а також Хочкиса, які показали за допомогою хроматографії, що чотири гетероциклічних підстави присутні в ДНК в неоднакових кількостях і що деякі зразки ДНК містять не чотири підстави, а більше. З часу цих досліджень перелік пуринових і піримідинових основ, що входять у нативні молекули ДНК, зріс до семи і уявлення про деталі будови ДНК зазнали суттєвих змін.

На підставі вивчення продуктів, одержуваних з ДНК при кислотному або ферментативному гідролізі, можна намітити наступні послідовні стадії її розпаду.

При гідролізі рибонуклеїнової кислоти (РНК), приблизно 0,9 якої знаходиться в цитоплазмі клітин, а 0,1 — в ядрі, утворюються ті ж продукти, тільки замість дезоксирибозы виділяється рибоза, а замість тиміну — урацил. Зв’язку, що з’єднують нуклеотиди в молекулі РНК, в основному схожі з такими в молекулі ДНК, проте про конфігурації молекули РНК відомо набагато менше.

ДНК → Нуклеотиди → Нуклеозиди + Фосфорна кислота → Пуринові і пиримидиновые підстави + Дезоксирибоза

У більшості зразків ДНК переважає чотири гетероциклічних підстави: пурини — аденін і гуанін — і пиримидины — тимін і цитозин. Однак деякі зразки ДНК (наприклад, ДНК зародків пшениці та інших злаків) містять у великих кількостях 5-метилцитозин; незначні кількості цього похідного цитозина виявлені також у препаратах з тканин ссавців. ДНК, одержана з «парних» групи фагів Т (Т2, Т4 і Т6), містить 5-оксиметилцитозин замість цитозина. Незвичайний пурин (6-метиламинопурин) виявлений у ДНК деяких бактерій. Однак при обговоренні загальних питань ми будемо мати на увазі лише чотири звичайних підстави.

Цукор, дезоксирибоза разом із залишками фосфорної кислоти утворює хімічний остов молекули ДНК. Оскільки дезоксирибоза має тільки три гідроксильні групи і оскільки одна з них (в положенні 1) бере участь в утворенні N-рибозидной зв’язку з одним з чотирьох гетероциклічних основ, що чергуються фосфорні залишки повинні бути пов’язані подвійний ефірної зв’язком з гідроксильними групами в положеннях 3 і 5. На основі цих відомостей ми можемо намалювати загальну картину будови ДНК. Для того щоб закінчити чисто хімічний опис ДНК, ми повинні лише додати до кожного вуглецю в положенні 1 відповідні пуринові або пиримидиновые підстави.

Це дуже важке завдання. Склад ДНК сильно варіює залежно від її походження; крім того, в даний час є достатньо даних на користь того, що більшість зразків ДНК, ймовірно, гетерогенны і, мабуть, являють собою суміш молекул, що розрізняються за змістом підстав і їх чергування. Незважаючи на ці труднощі, аналіз багатьох зразків ДНК, отриманих з різних біологічних джерел, привів до встановлення наступних кількісних співвідношень, які зазвичай спостерігаються в природі з більшими чи меншими відхиленнями.

1. Стехіометричне рівність між сумою пуринів і сумою піримідинів.

2. Зміст аденіну і тиміну відповідає змістом гуаніна і цитозіна (або суми цитозина і його менш поширених похідних, якщо такі присутні). Існує два типи ДНК: один, в якому сума аденіну і тиміну більше, ніж сума гуаніна і цитозіна (тип АТ), і протилежний тип ГЦ), виявляється головним чином у мікроорганізмів.

3. Зміст 6-аміногруп одно змістом 6-кетогрупп.

Крім того, є ряд умов, яким повинні задовольняти дані про послідовність підстав; цих даних поки ще мало, але вони швидко накопичуються.

Зазначені закономірності самі по собі говорять про те, що молекули ДНК, ймовірно, побудовані за певним планом і що розташування гетероциклічних основ має, мабуть, велике значення у функціональних особливостях ДНК.

Інші наявні в даний час дані також свідчать про те, що послідовність підстав жодним чином не може бути випадковою. Наприклад, Синсхеймер виділив з часткових гідролізатів ДНК багато різних динуклеотидных фрагментів. Окремі наведені поєднання зустрічаються набагато частіше, ніж інші. Нещодавно Шапіро і Чаргафф провели подібні досліди по фракціонуванню; на підставі отриманих результатів вони зробили висновок, що принаймні 70% піримідинів в різних зразках ДНК зустрічаються у складі «олігонуклеотидних відрізків», де вони утримуються поспіль у трьох або більше мононуклеотидах. Згідно з трьома наведеними вище правилами, такий тип скупчень повинен спостерігатися також для пуринів.

На даний момент жодних інших даних по основному цікавить нас питання — послідовності підстав — ні. Однак досягнуті вирішальні успіхи у вивченні просторової конфігурації молекули ДНК. Велика частина наявних у цій області даних заснована на результатах образотворчих досліджень одержаної з різних джерел ДНК методом рентгеноструктурного аналізу. Картини дифракції у всіх випадках були напрочуд схожими, свідчачи про те, що молекулярна структура всіх цих ДНК однорідна. Отримані дані показали, що молекула ДНК містить дві або більше полінуклеотидних ланцюгів, що утворюють спіральну структуру, і дозволили приблизно визначити розміри спіралі.

Використовуючи дані Уїлкінса і його співробітників та враховуючи різноманітні стерические обмеження, Уотсон і Крик сконструювали модель, відповідну більшої частини експериментальних даних. Ця модель, незважаючи на деякі недоліки, які згодом були усунені Уїлкинсом і його співробітниками, виявилася надзвичайно плідною стимулом для робіт в області хімії нуклеїнових кислот і генетики. В основу моделі Уотсона і Крику, крім аналітичних даних про змісті основ у молекулі ДНК і результатів рентгеноструктурного аналізу, лягли також факти, виявлені в дослідженнях з застосуванням титрування і показують, що полинуклеотидные ланцюга в молекулі ДНК з’єднані один з одним водневими зв’язками через залишки підстав.

Допущення, прийняті Уотсоном і Кріком, зводяться до наступного: 1) число ланцюгів у молекулі дорівнює двом; 2) завдяки специфічному способу попарного з’єднання підстав будь-яка пара підстав симетрична і рівноцінна будь-який інший в якості поперечного містка, що з’єднує дві нитки углеводофосфатного кістяка.

Постулированные для цієї моделі пари підстав аденін — тимін і гуанін — цитозин, пов’язані між собою водневими зв’язками, взятої з роботи Полінга і Кору, які детально розібрали модель ДНК у вигляді чвойной спіралі з точки зору кристалічних особливостей пуринів і піримідинів. Результати їх досліджень показали, що між цитозином і гуаніном можливе утворення трьох водневих зв’язків і тому в моделі ДНК слід надавати ще більше значення специфічності попарного з’єднання підстав, ніж це робили Уотсон і Крик, думали, що між попарно з’єднані підставами утворюється лише дві водневі зв’язки.

У моделі є цікава особливість: дві нитки полінуклеотидів комплементарны, т. тобто доповнюють одна іншу, і розташування нуклеотидів в одній нитки визначає розташування їх в інший. Так, якщо в однієї нитки послідовність підстав має вид А—Р—Р—Т—Ц—А, то в комплементарної нитки вони розташуються в порядку Т—Ц—Ц—А—Г—Т. Цей факт має певне значення для пояснення процесу подвоєння генетичного, до розгляду якого ми незабаром перейдемо.

Модель Уотсона — Крика отримала значну підтримку; вона, безумовно, являє собою чудову робочу гіпотезу. Однак ми повинні пам’ятати, що це лише модель, і тому вважаємо за необхідне розглянути всі доводи за і проти неї.

Дані, що підтверджують наявність подвійної спіралі, були отримані в роботах Томаса, а також Шумейкера, Річардса і Шахмана. В обох роботах на підставі досліджень змін розсіювання світла і в’язкості в процесі часткового ферментативного перетравлення ДНК, був зроблений висновок, що в основному молекула ДНК складається з двох ланцюгів, пов’язаних один з одним. Автори розрахували, що якщо б молекула ДНК складалася з одного ланцюга, то середня молекулярна вага отриманих фрагментів ДНК був би значно менше спостерігається в досвіді і що спостережувані факти добре узгоджуються з припущенням про систему досить міцних поперечних зв’язків між двома полинуклеотидными ланцюгами.

Ряд найбільш переконливих даних на користь структури, що складається з двох взаємодоповнюючих ланцюгів, отриманий Месельсоном і Сталем, які застосували методику центрифугування, розроблену Виноградом і його групою в Каліфорнійському технологічному інституті. Виноград використовував здатність концентрованих розчинів солей (наприклад, хлористого цезію) утворювати градієнт щільності під впливом центрифугування при великих швидкостях.

Таке макромолекулярное речовина, як ДНК, розчинена в розчині солі, знаходить всередині градієнта відповідну йому щільність і утворює в камері центрифуги щодо чітку лінію; цю лінію легко виявити за сильного поглинання ультрафіолетових променів. Якщо є два типи ДНК, що розрізняються по щільності, то вони розділяються і утворюють дві помітні зони. Таким шляхом, наприклад, у суміші двох ДНК — нормальної і містить більш важкий піримідин (бромурацил) — вдається визначити відносну кількість тієї та іншої ДНК.

Месельсон і Сталь вирощували кишкову паличку на живильному середовищі, що містила в якості джерела азоту лише важкий ізотоп N 15. і отримали популяцію, суцільно мічену цим ізотопом. Потім вони переносили клітини, взяті в період логарифмічного росту на середовище, компоненти якої містили N 14. Першу пробу для дослідження брали після того, як популяція подвоїлася, а другу — після того, як вона подвоїлася вдруге. З обох цих проб, а також з вихідних клітин, повністю мічених N 15. готували препарати ДНК. Потім кожен з отриманих препаратів розчиняли в концентрованому розчині хлористого цезію, щільність якого наближалася до щільності ДНК, і центрифугували до тих пір, поки в центрифугируемой рідини не встановлювалося стан рівноваги. ДНК, одержана з препаратів бактерій, мічених N 15. дає одну смугу, що відповідає щільності, характерної для N 15-ДНК. У препараті ДНК з проби, взятої після першого поділу, ця смуга зникла і її замінила смуга з щільністю, характерною для суміші рівних кількостей N 14-ДНК і N 15-ДНК. Нарешті, препарати з проб, узятих після двох поділок, дають дві смуги: одна з них відповідає 100% N 14-ДНК, а інша — суміші N 14 — і N 15-ДНК у відношенні 50:50.

У тих дослідах, де їм була надана можливість розмножуватися з утворенням подальших поколінь, смуга, відповідна суміші, все більше і більше звужувалася і заміщалася смугою, що відповідає N 14-ДНК. Якщо б у процесі подвоєння ДНК була проміжна стадія розпаду ДНК на більш дрібні фрагменти з подальшим використанням цих фрагментів для синтезу нових молекул ДНК, то щільність молекул ДНК з бактерій першого покоління не могла б так точно відповідати специфічної еквімолярної суміші «легких» і «важких» ланцюгів. В таких умовах скоріше слід було б очікувати широкого діапазону густин, чого насправді не було виявлено.

Отримані результати добре узгоджуються з гіпотезою Уотсона і Крику. Кожну нитку подвійної спіралі ДНК можна розглядати як матрицю, за зразком якої в процесі подвоєння будується нова нитка. У разі немеченных нуклеотидів-попередників слід очікувати, що дві дочірні спіральні нитки, що утворилися при одному подвоєння, виявляться міченими наполовину. Після другого подвоєння вийде по дві мічених і по дві немеченых нитки. Попарне поєднання підстав забезпечує точність в побудові комплементарних ниток, підтримуючи, таким чином, генетичну сталість.

Схема попарного з’єднання підстав, запропонованої Уотсоном і Кріком, отримала сильну підтримку з боку Корнберга і його співробітників, які проводили энзимологическое вивчення синтезу in vitro молекул, подібних з ДНК. З екстрактів мікробів вони виділили чистий фермент, який в присутності «затравки» у вигляді ДНК каталізував конденсацію дезоксирибонуклеозидтрифосфатов з утворенням довгих полидезоксинуклеотидных ланцюгів і з звільненням пірофосфату. У подальших дослідженнях ступінь чистоти ферменту була підвищена в 4000 разів порівняно з вихідним екстрактом, і був виявлений ряд важливих особливостей цієї системи. Найбільш важливе відкриття полягало в тому, що до складу знову синтезованого полімеру (має молекулярний вага близько 5 · 10 6 ) входять ті ж пуринові і пиримидиновые підстави та у тих же співвідношеннях, які характерні для «затравки», незважаючи на те, що всі трифосфати додавалися в однакових кількостях. Наприклад, при додаванні ДНК з Aerobader aerogenes, для якої характерне ставлення (Аденін + Тимін). (Гуанін + Цитозин) = 0,82, индуцировалось освіта «ДНК», в якій це ставлення було дорівнює 0,99. При запровадженні ДНК фага Т2, в якій це відношення дорівнює 1,91 знову синтезованого полімеру воно було одно 1,98. Згідно з допущенням Уотсона і Крику щодо утворення пар підстав, дезоксиуридинтрифосфат включався в ДНК тільки замість тимидинтрифосфата, а дезоксиинозинтрифосфат — тільки замість дезоксигуанозин трифосфату. Ці дані являють собою важливий крок вперед: вони не тільки допомагають з’ясувати структуру ДНК, але і можуть послужити в майбутньому ключем для синтезу полйдезоксинуклеотидов зі специфічною біологічною активністю.

Всі описані вище експерименти мали справу з генетичним матеріалом на молекулярному рівні. Результати цих експериментів набудуть значення для біології лише в тому випадку, якщо їх вдасться використати для пояснення поведінки ДНК на рівні організованої хромосоми або ж якщо вони хоча б будуть сумісні з цією поведінкою. Екстраполяція в даному випадку дуже смілива, і тому багато чого доводиться приймати на віру. Ми можемо, наприклад, визначити, що одна гаплоїдна клітина лілії містить приблизно 53 · 10 -12 r ДНК. Допустивши, що ця ДНК має вигляд довгої подвійної спіралі можна обчислити, що довжина цієї спіралі дорівнює 1,5 · 10 7 μ або 15 м, і число витків в ній дорівнює 4,4 · 10 9. Механічні проблеми, пов’язані з розкручуванням такої спіралі під час процесу подвоєння, настільки великі, що ця проста картина втрачає всякий сенс.

Незважаючи на величезний розрив між знаннями про будову ДНК і про структурі хромосоми, нещодавно проведені досліди по вивченню подвоєння хромосом ясно показують, що необхідно створити якусь гіпотезу, яка об’єднувала б хімічні та цитологічні дані. Тейлор та інші виконали на клітинному рівні досвід, еквівалентний експерименту Месельсона і Сталя. Застосовуючи методику, подібну з методикою, використаною Говард і Пелком, вони вивчили розподіл мітки між дочірніми клітинами в послідовних поколіннях. Однак їх методика виявилася набагато точніше, оскільки в якості міченого попередника ДНК вони застосовували не радіоактивний фосфат, а тимидин, мічений тритієм. Оскільки тритій випускає р-частинки, що володіють значно меншою енергією, ніж частинки, що випускаються фосфором, місця почорніння на плівці набагато більш чітко обмежені і виходять радиоавтографы досить точно відповідають клітинним структурам, які спостерігаються під мікроскопом.

Проростки Vicia faba вирощували на середовищі, що містить тимидин, мічений тритієм. Протягом інкубації більша частина (12) хромосом придбала мітку, про що свідчить відповідність між розташуванням зерен срібла на фотографічної емульсії і картиною хромосом, що спостерігається під мікроскопом. На цій стадії корінці переносили в містить колхіцин розчин нерадіоактивного тимидина і інкубували протягом різних проміжків часу. У присутності колхіцину хромосоми скорочуються до метафазного стану, сестринські хроматиди (дві окремі нитки подвійний хромосоми) відходять один від одного, і їх легко спостерігати. Оскільки колхіцин гальмує характерне для анафази розбіжність хромосом і подальше утворення дочірніх клітин, але не пригнічує подвоєння хромосом, підрахунок пар хромосом в кожній клітині дозволяє встановити, скільки разів відбувалося подвоєння хромосом. Таким чином, в клітинах, що містять 24 і 48 хромосом, подвоєння відбулося відповідно один і два рази.

Тейлор і його співробітники виявили, що в клітинах з 24 хромосомами в кожній парі метафазных хромосом міченої виявилася лише одна з хроматид. Отже, після видалення проростків з вихідного розчину запас міченого попередника в клітинах швидко виснажився і при подвоєння хромосом (в результаті якого їх стало 24), використовувався нерадіоактивний тимидин.

В клітинах, що містять по 48 хромосом, провести аналіз всіх хромосом було неможливо. Однак частина з них лежала досить далеко від інших, і їх можна було добре розглянути; приблизно у 50% цих хромосом одна із сестринських хроматид виявилася міченої, а інша — ні, у решти 50% немеченными залишалися обидві хроматиди. Іноді в парі хромосом «другого покоління» окремі сестринські хроматиди виявилися міченими лише частково, і в цих випадках відповідний ділянку іншій хроматиди також був радіоактивним. Подібної картини варто було б очікувати у випадку перехреста, й вона нагадує цитологічні спостереження, зроблені на хромосомах інших видів (наприклад, на гігантських хромосомах дрозофіли).

Отримані результати схематично представлені. Ця схема припускає, що кожна хромосома складається з двох половинок, які з’єднані центромерой і утворені з двох однакових ниток. У початковий період включення мітки кожна хроматида стає радіоактивною, і фігури метафаз в клітинах, що містять по 12 хромосом, можна чітко пов’язати з почорніння емульсії. Після другого подвоєння кожна пара хромосом все ще радіоактивна, проте вся мітка знаходиться в вихідної материнської нитки, а знову утворилася нитка радіоактивністю не володіє.

Ла-Курей і Пеле нещодавно повторили ці досліди в відсутність колхіцину. В їх дослідах радіоактивність була розподілена між обома хроматидами. У період подвоєння вільних мічених попередників не було. Ці результати повністю протилежні даними Тэйлооа, Вудса і Хьюза,

Оскільки мало ймовірно, що подвійна спіраль ДНК тягнеться уздовж всієї хромосоми, Тейлор, Вудс і Хьюз запропонували цікаву модель, яка відповідає як з даними, отриманими в їх дослідах з радіоактивними ізотопами, так і теоретичним допущеннях про наявність подвійної спіралі. Згідно цієї моделі, хромосома має серцевину, що складається з двох половинок, причому до кожної з цих половинок прикріплюється по одній нитці від кожної з безлічі подвійних спіралей.

Коли клітина вступає в мітоз, ці половинки розходяться, причому кожна з них веде з собою одну з двох комплементарних полінуклеотидних ланцюгів. Тейлор і його співробітники зазначають, що ця модель вводить в пояснення явища перехреста ще одне нове вимірювання, а саме: звичайний перехрест може відбуватися шляхом обміну вздовж серцевини, тоді як більш дрібні рекомбінації і генні конверсії можуть відбуватися шляхом взаємодії або обміну між бічними ланцюгами ДНК.

Підводячи підсумки, можна сказати, що на користь припущення про існування в молекулі ДНК комплексу перевитих спіральних ланцюгів полінуклеотидів свідчать дані. Модель, запропонована Уотсоном і Кріком, в даний знову ставлять питання про те, чи здійснюється подвоєння цілком «консервативного» механізму, при якому хромосомна нитка, одного разу утворившись, зберігається в ядрі у вигляді більш або менш незмінною хімічної структури.

час представляється найбільш задовільною. Хоча Донохью показав, що для побудови моделей у вигляді подвійної спіралі, можна підібрати деякі інші комбінації пар основ, однак вони не відповідають дифракційної рентгенограмі ДНК, і в даний момент найбільш імовірними видаються пари аденін — тимін і гуанін — цитозин. Комплементарність двох ниток ДНК послужила основою для побудови цікавої гіпотези про подвоєння генетичного матеріалу, якій відповідають експериментальні дані як на молекулярному, так і на клітинному рівні.

Перейдемо до короткого огляду даних, які не вкладаються в рамки гіпотези Уотсона і Крику. Їх не так багато, як тих, які свідчать на користь цієї гіпотези, можливо тому, що вчених, так само як і інших громадян, залучає сенсація.

Було висловлено думку, що гіпотезу про подвоєння ДНК, засновану лише на комплементарної структурі полінуклеотидних ланцюгів, важко примирити з деякими аналітичними даними про кількість окремих нуклеотидів. Синсхеймер виділив ряд динуклеотидов з ДНК зобної залози теляти, серед яких є гомологічні динуклеотиды, містять цитозин і 5-метилцитозин. Його дані показують, що в розподілі цитозина і 5-метилцитозина спостерігаються значні відмінності, тобто включення, мабуть, відбувається не за законом випадку. Ці дані носять кілька попередній характер, проте вони показують, що однією лише комплементарності недостатньо для пояснення закономірного розподілу підстав. Немає ніяких явних стеріческіх перешкод тому, щоб 5-метилцитозин не міг включатися в тих положеннях, які зазвичай займає цитозин, і Синсхеймер правильно вказує на можливість існування якихось додаткових шляхів у метаболізмі нуклеотидів, які дозволять пояснити подібні відхилення від простих закономірностей.

Синсхеймер призводить також більш серйозне заперечення проти простого комплементарного механізму подвоєння ДНК. Фаг Т2 замість 5-цитозина містить 5-оксиметилцитозин, причому близько 77% останнього пов’язано з глюкозою. Багато досліджень показали, що ДНК фага Т2 складається з одного великого фрагмента, який становить приблизно 40% всієї її маси, і ряду дрібніших фрагментів. Весь непов’язаний 5-оксиметилцитозин виявлений у великому фрагменті; це означає, що лише близько 60% його у великому фрагменті пов’язано з глюкозою, тоді як все більш дрібні фрагменти містять глюкозу. Синсхеймер зазначає: «Оскільки подвоєння всіх цих компонентів ДНК фага Т2 відбувається в одній клітці і в один і той же час, обмежене включення глюкози у великому фрагменті, мабуть, можна віднести за рахунок якогось недоліку метаболізму. Тому створюється враження, що в процесі подвоєння великого фрагмента механізм сам «знає», куди включити 5-оксиметилцитозин, що містить глюкозу, а куди вставити незамещенный оксиметилцитозин, так як вміст глюкози залишається постійним протягом багатьох поколінь». Ці спостереження. можна пояснити, припустивши, що 5-оксиметилцитозин і його глюкозозамещенный аналог мають при формуванні ланцюга різними стерическими особливостями, завдяки яким помилок у визначенні послідовності їх розташування відбутися не може. Заперечення, які висуває Синсхеймер щодо простого комплементарного механізму, дуже корисні як для того, щоб дещо зменшити надмірний ентузіазм, так і самі по собі.

Деякі з найбільш цікавих даних, що суперечать гіпотезі Уотсона і Крику, отримані Стентом і його співробітниками; вони описали загибель фагів, мічених Р 32. в результаті радіоактивного розпаду. Однак ці досліди важко викласти без попереднього знайомства з біологією фага.

Поділіться посиланням з друзями

Короткий опис статті: будова днк Одне з найбільш чудових досягнень сучасної біохімії — це встановлення будови дезоксирибонуклеїнової кислоти з точки зору як її складу

Джерело: Хімічна будова ДНК

Також ви можете прочитати